Lu Fan, Ole Jung, Markus Herrmann, Marina Shirokikh, Sanja Stojanovic, Stevo Najman, Fabian Körte, Xin Xiong, Katja Schenke-Layland,* und Mike Barbeck
Die Kollagenvernetzung mit ultravioletten A-Strahlen und Riboflavin (UVA/R) hat sich seit den 1990er Jahren als zentrale Technik in klinischen Therapien etabliert, insbesondere in der Augenheilkunde. Trotz seiner klinischen Einführung erfordert die mangelnde Klarheit des detaillierten Mechanismus und die Notwendigkeit eines verfeinerten Herstellungsprozesses weitere Untersuchungen. Diese Studie fördert das Verständnis des UVA/R-Kreuzvernetzungskollagens, konzentriert sich auf die Identifizierung der primären Vernetzungsstellen mit sieben synthetischen Peptiden und die Erforschung der Routen von Riboflavin. Vermittelte Vernetzung.
Die Ergebnisse zeigen, dass Tyrosinreste wichtige Vernetzungsstellen sind und Riboflavin sowohl als Katalysator als auch als kompetitiver Inhibitor im Vernetzungsprozess fungiert. Darüber hinaus zeigt die UVA/R-Kreuzverband Kollagenmatrix ein harmonischeres Gleichgewicht zwischen Stabilität und Abbaubarkeit im Vergleich zu chemisch vernetzten Kollagenmatrizen, verbunden mit überlegenen mechanischen Eigenschaften und erhöhter Biokompatibilität. In-vivo-Experimente weiter.
1. Einleitung
Kollagene wurden in verschiedenen biomedizinischen Bereichen umfangreich als funktionelle Biomaterialien eingesetzt, darunter Wundheilung, Knochentransplantate und Regeneration, Ophthalologie, kardiovaskuläre und neuronale Gewebetechnik. Um die Funktion der Kollagene, hauptsächlich des Kollagens Typ I (Kollagen), in diesen Anwendungen zu optimieren, ist Crosslinking oft unerlässlich, um ihre mechanischen Eigenschaften, Biostabilität, Biokompatibilität und andere Funktionen zu verbessern. Unter den verschiedenen Crosslinking-Technologien stechen ultraviolette A-Strahlen und Riboflavin (UVA/R)-Crosslinking als besonders vielversprechende Technik hervor, die seit den frühen 1990er Jahren für den klinischen Einsatz in der Augentherapie zugelassen ist. Diese inhärente Bequemlichkeit und Sicherheit bergen enormes Potenzial, die Anwendung von Kollagenen in verschiedenen biomedizinischen Bereichen zu erweitern.
Das Gebiet der UVA-Photocrosslinking entwickelt sich rasant weiter und offenbart vielversprechende Anwendungen in medizinischen Disziplinen. Seine Nützlichkeit erstreckt sich nun auf die Entwicklung innovativer Hydrogele, die darauf abzielen, postoperative Verwachsungen zu minimieren, was das Potenzial hat, die laparoskopische Chirurgie wiederherzustellen. Darüber hinaus werden UVA/R-vernetzte azelluläre Hornhaut bei Schweinebeinen als potenzielles Gerüst für Boston Keratopros-Thesis bewertet, was bedeutende Fortschritte in Biokompatibilität und Effizienz widerspiegelt. Die Anwendung dieser Technik hat sich diversifiziert, mit bahnbrechenden Methoden wie der glutaraldehydfreien Präparation für Herzimplantate, Meniskusgewebetechnik, kontrollierter Arzneimittelabgabe-Methode und erweitert ihren Einfluss auf bahnbrechende Forschungsbereiche wie 3D-Bioprinting und Organ-on-a-Chip-Systeme, was das dynamische Potenzial der UVA/R-Vernetzung in der modernen Biomedizintechnik aufzeigt.
Trotz dieser vielversprechenden Anwendungen bleibt der Mechanismus der Trennung von UVA/R-Vernetzung ein Gebiet anhaltender Nachforschungen und Debatten. Viele Studien legen nahe, dass Riboflavin hauptsächlich als Photokatalysator fungiert, der reaktive Sauerstoffspezies (ROS) erzeugt, um Kollagenoxidation und Polymerisation zu induzieren. Alternative Theorien besagen, dass dies ein viel komplexerer photochemischer Prozess ist, der von der Sauerstoff- und/oder UVA-Exposition abhängt. Es gibt auch Debatten über die spezifischen Vernetzungsstellen auf Kollagenmolekülen, wobei einige Nichtselektivität behaupten, während andere auf Aminosäuren wie Ly-Sin, Histidin, Arginin, Tyrosin oder Methionin hinweisen.
Diese unterschiedlichen Standpunkte zu UVA/R-Vernetzungsmechanismen unterstreichen ein Mangel an umfassendem Verständnis und stellen Herausforderungen bei der Standardisierung von Fertigungsprozessen und der regulatorischen Bewertung von Medizinprodukten dar. Um diese Wissenslücken zu schließen und möglicherweise die Anwendungen mit Kollagen zu erhöhen, untersucht unsere Studie die grundlegenden Prinzipien der UVA/R-Vernetzung.
Indem wir alternative mechanistische Erklärungen untersuchen und die komplexen Wechselwirkungen zwischen Kollagen und Ri-Boflavin aufdecken, liefern wir wertvolle Erkenntnisse, die zur Verfeinerung und Optimierung der UVA/R-Vernetzungstechniken beitragen. Die Untersuchung des Vernetzungsmechanismus im Kollagen stellt jedoch aufgrund der dynamischen photochemischen Prozesse und der molekularen Komplexität des Kollagens erhebliche Herausforderungen dar. Um diese detaillierten Mechanismen zu entschlüsseln, sind fortschrittliche experimentelle Technologien und umfassende analytische Methoden erforderlich, um die transienten Zwischenprodukte und Wege genau zu identifizieren und zu charakterisieren. Darüber hinaus fügt die Variabilität der physikalischen und chemischen Eigenschaften des Kollagens, beeinflusst von Kollagenherkunft, -typ, Verarbeitung und Umweltfaktoren diese Studien zu Schwierigkeitsgraden und erfordert einen nuancierten Ansatz, um den Crosslinking-Prozess vollständig zu verstehen.
In unserer Studie verwendeten wir einen innovativen experimentellen Rahmen, bei dem wir sieben synthetische Peptide synthetisierten, die Kreuzpotenzial-Vernetzungsstellen auf Kollagen repräsentieren, mit Fokus auf Aminosäurereste wie Tyrosin (Y), Lysin (K), Arginin (R), Methionin (M), Hitidin (H), Tryptophan (W) und Phenylalanin (F). Diese Aminosäuren wurden aufgrund ihrer reaktiven Gruppen und Positionen im nicht-helikalen Bereich des Kollagenmoleküls ausgewählt, was für Vernetzungsreaktionen besser zugänglich ist und entscheidend für die Verbesserung mechanischer Eigenschaften ist. (Abbildung 1) Durch die Aussetzung dieser Peptide und des nativen Kollagens gegenüber unterschiedlichen UVA-Energie- und Ri-Boflavin-Verhältnissen haben wir den Vernetzungsprozess mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zerlegt. Wir verglichen außerdem UVA/R-Vernetzung mit chemischen Vernetzern und nutzten Raman-Mikrospektroskopie, um nach der Vernetzung unterschiedliche molekulare Veränderungen zu erkennen. Wir bewerteten mechanische Festigkeit, thermische Stabilität, Abbauwiderstand und Zytotoxizität, was in vivo-Implantationsstudien zur Bewertung der Biokompatibilität und des Geweberegenerationspotenzials gipfelte.
Durch die Analyse des Vernetzungsprozesses auf molekularer Ebene offenbart unsere Studie wichtige Einblicke in die Rolle und Wechselwirkungen spezifischer Aminosäuren und wirft Licht auf die komplexen Dynamiken der UVA/R-Vernetzung. Diese Entdeckungen haben erhebliche Auswirkungen auf die Weiterentwicklung der Biomaterialwissenschaft und schaffen eine Grundlage für die Entwicklung fortschrittlicher, biokompatibler und mechanisch robuster Biomaterialien und ebnen so den Weg für effektivere und sicherere biomedizinische Anwendungen.
Abbildung 1. Schaltplan der UVA/Riboflavin-Kollagenvernetzung. UVA: Ultraviolettes A-Licht, die Quelle der Photoaktivierung. R: Riboflavin im Grundzustand. R*: angeregter Zustand von Riboflavin bei der ersten UVA-Exposition. 3 R*: Triplet-Zustand ri-boflavin nach Intersystem-Crossing, ein höherenergetischer Zustand, der in der Lage ist, Vernetzungsreaktionen durchzuführen. O2: molekularer Sauerstoff. 1 O2: Singlet-Sauerstoff, eine reaktive Sauerstoffspezies, die durch den Energietransfer von photoaktiviertem Riboflavin auf molekularen Sauerstoff erzeugt wird. HO2 •: Hydroperoxylradikal. RH: allgemeine Struktur, die einen Wasserstoffspender repräsentiert. Rox: oxidierte Form des Hy-Drogen-Donors nach Wasserstofftransfer. Aminosäuren: Y (Tyrosin), K (Lysin), R (Arginin), M (Methionin), H (Histidin), W (Tryptophan, nicht vorhanden im porcinen Kollagen Typ I), F (Phenylalanin).
2. Ergebnisse und Diskussion
2.1. Präparation und Charakterisierung der Kollagenmatrix
Typ-I-Kollagen, das aufgrund seiner starken Ähnlichkeit mit menschlichem Gewebe aus der Schweinehaut stammt, bietet ein robustes Fundament für die Gewebetechnik. Diese Form von Kollagen ist ideal für biomedizinische Anwendungen aufgrund ihrer Häufigkeit in der Haut und ihrer klar definierten dreihelixigen Struktur, die aus zwei α1-Ketten und einer α2-Kette besteht (Abbildung2A). SDS-PAGE zeigte die Integrität und Reinheit unseres schweinebasierten Kollagens nach einer Reihe von mechanischen Homogenisierungsprozessionen an, wobei Rattenschwanzkollagen als Kontrollmechanismus verwendet wurde.
Abbildung 2B zeigt unterschiedliche Bänder im SDS-PAGE-Gel sowohl für das von der Schweinehaut abgeleitetes Kollagen (P-Col) als auch für das vom Rattenschwanz-abgeleitete Kollagen (R-Col) und hebt die α 1- und α2-Bänder bei ≈150 bzw. 140 kDa hervor. Weitere Bänder unterhalb der 100 kDa wurden nicht beobachtet. Höhere Molekulargewichtsbänder, wie Dimere (β) und Trimere (y), waren ebenfalls erkennbar, was auf die hohe Reinheit der Kollagenmatrix und die erhaltene Integrität nach mechanischer Verarbeitung hinweist. Die zirkuläre Dichroismus (CD)-Spektroskopie lieferte weitere Bestätigung und zeigte charakteristische negative und positive Spitzen, die auf das Vorhandensein der gut erhaltenen dreihelikalen Konformation des Kollagens hinweisen (Abbildung2C). Eine derart hohe Reinheit und strukturelle Integrität sind entscheidend für die effektive Verbindung mit Vernetzungsmitteln und eine präzise Analyse mechanischer Eigenschaften.
Die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde eingesetzt, um morphologische Veränderungen in den Kollagenmatrizen vor und nach der UVA/R-Vernetzung zu untersuchen. (Abbildung 2D) Anfangs zeigte das nicht gekreuzte Kollagen im hydratisiert-gefrorenen Zustand eine einzigartige, kristallartige Oberflächentextur, die durch die während der Herstellung durchgeführten Rührring-/Schaumprozesse von der konventionellen fibrillaren Struktur abwich (Abbildung 2Da). Diese absichtliche Störung war für das weitere Matrixdesign notwendig. Nach der Vernetzung wurde eine bemerkenswerte Transformation in der UVA/R-Quervernetzungs-Kollagenmatrix beobachtet. Sie zeigte eine komplexe, poröse Architektur mit miteinander verbundenen Hohlräumen und Poren, die von 1 bis 20 μm groß waren, was zu ihrer dreidimensionalen Komplexität beitrug. (Abbildung 2Db) Die Heterogenität der Porengröße kann eine natürlichere und dynamischere Umgebung für Zellen fördern, was eine vielfältige Zelladhäsion, Migration und Nährstoffentwicklung ermöglicht, die für die Geweberegeneration und -regeneration entscheidend sind. Darüber hinaus können die umstrukturierten Kollagenfasern mechanische Hinweise verstärken, die die zelluläre Ausrichtung und Dierentierung steuern und so zur Bildung einer funktionaleren und organisierteren Gewebestruktur in biomedizinischen Anwendungen beitragen.
Darüber hinaus deuten die Verdichtung und erhöhte Stillheit durch die Lyophilisation auf eine erhöhte Widerstandsfähigkeit gegenüber mechanischer Verformung hin, ein wesentliches Merkmal von Biomaterialien, die physiologischen Belastungen ausgesetzt sind (Abbildung 2Dc,d). Diese erhöhte mechanische Robustheit gewährleistet nicht nur die strukturelle Integrität der Kollagenmatrix unter unterschiedlichen physikalischen Bedingungen, sondern verlängert potenziell auch ihre funktionelle Lebensdauer und macht sie für langfristige biomedizinische Anwendungen wie implantierbare Geräte oder Gewebe-Sca-Olds geeigneter.
Abbildung 2. Strukturelle und mechanische Charakterisierung der Kollagenbehandlung vor und nach UVA/Riboflavin. A) Molekularmodell der Collage-Typ I Dreifachhelixstruktur, dem grundlegenden Baustein der Kollagenmatrizen. B) SDS-Page-Analyse, die die Charakterisierung von Kollagentyp I aus Rattenschwanz (R-Col) und Schweinehaut (P-Col) abbildet. C) Zirkuläre Dichroismus (CD)-Spektren von R-Kol und P-Kol, wobei die Elliptizität auf die Erhaltung der kola-gen-sekundären Struktur hinweist. D) Bilder der Rasterelektronenmikroskopie, die die morphologische Untersuchung von nicht gekreuzten Kollagen und UVA/R-Kreuzvernetztem Kollagen im hydratisiert-gefrorenen Zustand (a,b) sowie im lyophilisierten Zustand (c,d) zeigen.
2.2. Erforschung des UVA/R-Vernetzungsmechanismus
Nachdem wir die grundlegenden Aspekte der Kollagenmatrixpräparation festgelegt und ihre Anfangseigenschaften analysiert hatten, tauchten wir dann in die Erforschung des Mechanismus der UVA/R-Vernetzung ein, einem entscheidenden Prozess, der die Eigenschaften der Matrix erheblich verändert und verbessert. Dieser Abschnitt untersucht, wo Quervernetzungen auf dem Kollagenmolekül entstehen, die Rolle von Riboflavin als Katalysator oder Beteiligter und postuliert weiter die Notwendigkeit von Anpassungen der Kollagen-UVA/R-Vernetzung in den verschiedenen Anwendungen.
2.2.1. Wo entstehen Crosslinks auf dem Kollagenmolekül?
In unserer Studie untersuchten wir den Vernetzungsmechanismus des Typ-I-Kollagens auf molekularer Ebene und konzentrierten uns auf nicht-helikale Regionen, die die mechanischen Eigenschaften nach der Vernetzung verbessern. Mit sieben synthetischen Peptiden, die entscheidende Aminosäuren repräsentieren – Tyrosin (Y), Lysin (K), Arginin (R), Methionin (M), Hitidin (H), Tryptophan (W) und Phenylalanin (F) – wollten wir spezifische Vernetzungsstellen identifizieren. Diese Aminosäuren wurden aufgrund ihrer besonderen reaktiven Funktionen und strategischen Positionen im Kollagen des Moleküls selektiert (Abbildung S1, Unterstützende Information). Konkret besitzt Tyrosin (Y) eine reaktive Phenolgruppe, die kovalente Bindungen eingehen kann. Lysin (K) und Arginin (R) sind mit Aminogruppen ausgestattet, die für die Bildung chemischer Bindungen dienen.
Histidin (H) wird durch einen Imidazolring charakterisiert, Phenylalanin (F) durch einen aromatischen Ring, beide haben potenzielle Reaktivitätsstellen. Unsere LC-MS-Analysen zeigten ein deutliches Muster: Modifikationen nach UVA/R-Behandlung traten ausschließlich in tyrosinhaltigen Pep-Tiden auf, wahrscheinlich aufgrund der Entstehung kovalenter Di-Tyrosin-Bindungen (Abbildung 3A,B). Diese Spezifität wurde zusätzlich durch das Fehlen kovalenter Bindungsprodukte in den anderen sechs Aminosäuren, einschließlich Peptiden, verstärkt, was die bevorzugte Rolle von Ty-Rosin im Vernetzungsmechanismus unterstreicht (Abbildungen S2 und S3, Sup-Porting-Informationen). Die Neigung zur Dityrosinbildung, die ursprünglich aus unseren synthetischen Peptidstudien angenommen wurde, wurde schlüssig durch die LC-MS-Analyse von Hydrolysaten von UVA/R-vernetztem Kollagen bestätigt (Abbildung 3C,D).
Während der Untersuchung des UVA/R-vernetzten Kollagens wurde Di-Tyrosin zuverlässig mittels Multireaktionsüberwachung (MRM) in der Massenspektrometrie identifiziert und durch Vergleiche mit einem Dityrosin-Standard authentifiziert. Bemerkenswert ist, dass unsere LC-MS-Untersuchung von Kollagenhydrolysaten einen Höhepunkt ergab, der dem Di-Tyrosin-Standard sehr ähnlich, aber dennoch unterscheidbar ist. In Anerkennung der Wahrscheinlichkeit isomerischer oder räumlicher Variationen innerhalb der Kollagenmoleküle schließen wir vorsichtig, basierend auf Massenüberlegungen, dass die zusammenfallenden Spitzen Dityrosinformen darstellen könnten (Abbildung S4, Unterstützende Informationen). Angesichts der Protein-Sequenz des schweineschen Typ-I-Kollagens (Zugangsnummern A0A1S7J210 für COL1A1 und A0A1S7J1Y9 für COL1A2) sollte das vollständige Stoffkollagenmolekül ein Molekulargewicht von 282,85 kDa aufweisen, das 3152 Aminosäurereste umfasst, einschließlich 13 Tyrosinresten.
Wenn wir annehmen, dass alle diese Tyrosinreste gleichermaßen reaktiv und für Quervernetzung verfügbar sind, deuten unsere LC-MS-Ergebnisse darauf hin, dass eine konservative Schätzung des gekreuzten Tyrosin innerhalb der Kollagenmatrix mindestens 14,3 % beträgt (Abbildung S5, Unterstützende Informationen). Diese Deduktion ist entscheidend für die Bewertung des Ausmaßes der durch UVA/R-Bedingungen verursachten Kollagenvernetzung und bereichert unser Verständnis ihrer Mechanismen.
Die Belegung von Dityrosin in hydrolysiertem UVA/R-Quervernetzungskollagen ist eine entscheidende Bestätigung der Exklusivität von Tyrosin im Vernetzungsschema. Solche Belege spiegeln nicht nur die experimentellen Ergebnisse der synthetischen Peptidforschung wider, sondern veranschaulichen auch die praktische Relevanz der Tyrosin-Vernetzung in Kollagenmatricen. Das Vorhandensein von Dityrosin dient als molekulares Kennzeichen erfolgreicher Vernetzung und bietet eine entscheidende Erkenntnis, die als entscheidend für die Verfeinerung der UVA/R-Vernetzungstechnologien im Kollagen für biomedizinische Anwendungen angesehen wird.
2.2.2. Riboflavin: Crosslink-Katalysator oder Teilnehmer?
Bei der Untersuchung der Rolle von Riboflavin bei der Kollagenvernetzung enthüllt unsere Studie seine doppelte Funktion sowohl als Katalysator als auch als Teilvernetzer. Durch die Untersuchung der Beziehung zwischen Tyrosin- und Ribollavin-Verhältnissen sowohl im Peptid- als auch im Kollagensystem beobachteten wir ähnliche bemerkenswerte Trends: eine positive Korrelation zwischen Crosslinking-Ecacy und Riboflavin bei niedrigeren Verhältnissen, die sich bei höheren Konzentrationen umkehren (Abbildung 3E). Zum Beispiel gab es bei Kollagen bei niedrigeren Riboflavinkonzentrationen (Tyrosin/Riboflavin-Verhältnisse von 1/0,0625 bis 1/0,25) einen signifikanten Anstieg des Altersmoduls im Vergleich zum nicht gekreuzten Kollagen. Bei höheren Konzentrationen verringert sich jedoch der Speichermodul stark (Abbildung 3F).
Die spürbare Verringerung der mechanischen Festigkeit von Col-lagen-Matrizen bei erhöhten Riboflavinkonzentrationen veranlasste eine Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen. Unsere Untersuchung wurde von einem theoretischen kinetischen Modell geleitet, das eine kritische Abhängigkeit der beiden Wegen des Riboflavin-vermittelten Photocrosslinkings auf den Sauerstoffgehalt in der Umgebung zeigt. Dieses Modell inspirierte unsere Entdeckung: Die Vernetzungseffizienz ist besonders empfindlich gegenüber der Riboflavinkonzentration, insbesondere in Umgebungen mit konstanter Sauerstoffverfügbarkeit.
Dieses nuancierte photochemische Verhalten von Riboflavin deutet auf zwei primäre Reaktionswege bei der UVA-Anregung hin, wie in Abbildung 1 dargestellt. Anfangs wirkt Riboflavin als Photokatalysator und erzeugt ROS, die die intermolekulare Vernetzung ermöglichen, vor allem an Tyrosinresten, die in den nicht-helikalen Bereichen des Kollagens liegen. Dieser Prozess verstärkt die mechanischen Eigenschaften der Matrix. Ein alternativer Weg wird jedoch bei höheren Riboflavinkonzentrationen vorherrschend, bei dem Riboflavin aktiv an der Vernetzungsreaktion beteiligt ist, das ROS verringert und dadurch die Wirkungskraft der Vernetzung verringert. Darüber hinaus können Elektronentransferprozesse Interaktionen zwischen positiv geladenen Aminosäureresten wie Lysin, Histidin und Arginin sowie negativ geladenem Riboflavin induzieren, was potenziell die mechanischen Eigenschaften der Kollagenmatrix beeinflussen kann. Dieser Aspekt verdient eine weitere experimentelle Validierung.
Zusätzlich wurde die UVA-Exposition zur Vernetzung des Kollagen-Matrix in unserer Studie ebenfalls optimiert. Unsere in Abbildung 3E dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die optimale UVA-Belichtung für Colla-Gen-Matrix-Crosslinking 10.800 mJ cm_2 betrug. Über diese UVA-Dosierung hinaus nahm der Speichermodul der Kollagenmatrizen deutlich ab, was auf eine mögliche Degradierung des Kollagengerüsts durch Überexposition hindeutet. Interessanterweise war bei der Peptidvernetzung die optimale UVA-Dosierung deutlich niedriger, nämlich 600 mJ cm_2 (Abbildung S6, Unterstützende Informationen); und in einer weiteren Arbeit identifizierten Ue-Mura et al., dass die optimale UVA-Exposition für menschliche Dentin-Kollagenvernetzung 1600 mJ cm_2 betrug.
Insgesamt decken diese Erkenntnisse eine zusätzliche Ebene des UVA/R-Vernetzungsmechanismus auf, die die entscheidende Notwendigkeit unterstreichen, die Riboflavinkonzentration und UVA-Exposition für praktische Anwendungen feinabzustimmen. Die bemerkenswerte Diskrepanz zwischen In-vivo-Gewebeumgebungen und in-vitro-Kollagen-Vernetzungssystemen ist erheblich. Variationen in Kollagenquellen (Tyrosinrestgehalt), Konzentration, Dichte und unterschiedlichen Pufferbedingungen erfordern maßgeschneiderte Ansätze zur Anpassung der Riboflavinkonzentration und UVA-Exposition, um optimale Vernetzungsergebnisse zu erzielen.
Abbildung 3. Die Analyse des UVA/R-Vernetzungsmechanismus im Kollagen. A) LC-MS-Chromatogramme nach der UVA/R-Behandlung des Ac-AGGY-NH2-Peptids mit Kontrollproben von Ac-AGGY-NH2 und Riboflavin. B) Massenspektren, die mit neu entstandenen Peaks (a–d) in Chromatogramen von UVA/R-behandeltem Ac-AGGY-NH2 korrelieren. C) LC-MS-Chromatogramme des Di-Tyrosin-Standards und Hydrolysate von nicht vernetztem Kollagen und UVA/R-Kreuzband-Kollagen, D) mit entsprechenden Massenspektren. E) Speichermodul (G') von Kollagen als Funktion der UVA-Exposition (mJ cm_2), was den dosisabhängigen Anstieg der mechanischen Eigenschaften zeigt. F) Speichermodul (G') im Verhältnis zum Tyr-Verhältnis (in Kollagen)/Riboflavin, was den Einfluss variierender Riboflavinkonzentrationen auf die mechanische Festigkeit der Kollagenmatrizen veranschaulicht.
2.3. Vergleichende Untersuchung der Auswirkungen von UVA/R und chemischer Vernetzung auf Kollagenmatrizen
Nach der Aufklärung der Komplexität des UVA/R-Vernetzungsmechanismus richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf die vergleichende Investigation, die darauf abzielt, die Auswirkungen unterschiedlicher chemischer Vernetzungstechniken auf Kollagenmatrizen umfassend zu bewerten. Jede Analyse trägt zu einem ganzheitlichen Verständnis der strukturellen und funktionalen Veränderungen bei, die durch UVA/R und andere chemische Vernetzungsmethoden induziert werden.
2.3. 1. Raman-Mikrospektroskopie
Die Raman-Mikrospektroskopie hat einen tiefgreifenden Einblick in die molekulare Integrität von Kollagenmatrizen geboten, die verschiedenen Vernetzungstechniken unterzogen werden. Detaillierte Spitzenzuweisungen zusammen mit den entsprechenden Quellen sind in Tabelle S3 (Unterstützende Informationen) zusammengestellt. In unserer Studie behielten Col UVA/R Kollagen (Xcol_UVA/R) und EDC/NHS Kollagen (Xcol_EDC/NHS) ihre typischen sekundären Strukturen nach der Vernetzung im Vergleich zu nicht-vernetztem Kollagen (Col) bei, wie die konsistenten Amidbänder in allen Proben zeigen: Amid III (1260 cm_1), Amid II (1452 cm_1) und Amid I (1664 cm_1)(Abbildung4A).
Die Spektren zeigten, dass die charakteristische Dreifachhelixstruktur des Kollagens erhalten blieb, es jedoch deutliche Reduktionen in der Intensität der Peaks (815, 936, 971 und 1080 cm_1) gab, die mit den Seitenketten-Vibrationen von Aminosäuren verbunden sind, die sowohl an UVA/R- als auch EDC/NHS-Vernetzungsreaktionen beteiligt sind. Solche Funde deuten auf subtile, aber eindeutige molekulare Umlagerungen innerhalb der Ar-Chitektur des Kollagens hin, insbesondere auf Schwingungsmodi wie C-C-Dehnung, C-C-Dehnung und CH3-Schwankungen in Lysin-, Hydroxylysin- und Tyrosinresten, die für den Vernetzungsprozess entscheidend sind.
Bemerkenswert ist, dass das Ausmaß der Intensitätsreduktion bei EDC/NHS-Crosslinked Colla-Gen ausgeprägter war, was auf eine höhere Häufigkeit von Lysin- und Hydroxylysin-vermittelten Crosslinks im Vergleich zu den Tyrosin-vermittelten bei UVA/R-Crosslinking hinweist. Eine interessante Verschiebung von 936 auf 927 cm_1 nach der EDC/NHS-Vernetzung deutet möglicherweise auf eine erhöhte Tension an, die durch Prolinrestpackung nach der Vernetzung verursacht wird.
Weitere Untersuchungen mittels multivariater Hauptkomponentenanalyse (PCA) bestätigten diese strukturellen Nuancen und unterschieden zwischen unbehandelten und vernetzten Proben (Abbildung 4B–D). Die unterschiedliche Clusterung der PC-3- und PC-4-Werte erläuterte die für jede Behandlung einzigartigen molekularen Grundlagen, wobei die UVA/R-Vernetzung im Vergleich zu ihrem chemischen Gegenstück einen eigenen molekularen Fingerabdruck aufweist. Die PC-3-Werte haben positive Werte für Xcol_UVA/R-Spektren und negative Werte für Col und Xcol_EDC/NHS erkennbar. Dieser Trend wurde im PC-3-Ladediagramm wiedergegeben, das deutliche Spitzen bei 936 cm_1 (Prolin) und 1688 cm_1 (Amide I) aufwies.
Gleichzeitig zeigten die PC-4-Werte positive Bereiche sowohl für Xcol_UVA/R als auch Xcol_EDC/NHS, während die Col-Spektren im negativen Bereich gruppierten. Die entsprechenden PC-4-Lasten zeigen gezielte quervernetzungsassoziierte Spitzen bei 896, 980, 1099, 1309, 1439 und 1655 cm_1, was die Schwingungsmoden 0 (C-C), 0 (C-N) sowie CH3/CH2-Verdrehung, Biegung oder Wagging-Modus-Deformation sowie andere verstärken und die beobachteten vernetzungsgetriebenen molekularen Unterschiede verstärkt.
Die Raman-Mikrospektroskopie lieferte molekulare Fingerabdruckmuster, die die Veränderungen auf molekularer Ebene im Kollagen nach der Quervernetzung sowie die unterschiedlichen Merkmale zwischen Kollagen, die durch UVA/R- und EDC/NHS-Methoden vernetzt wurden, aufklären. Diese spektroskopischen Ergebnisse sind entscheidend für die Funktionalisierung von Kollagen für fortgeschrittene biomedizinische Anwendungen.
2.3.2. Größen-Ausschluss-Chromatographie der verdauten Kollagenmatrix
Die Größenausschlusschromatographie (SEC) von kollagennase-verdauten Proben zeigte deutliche Unterschiede im molekularen Profil der Kollagenmatrizen nach der Vernetzung (Abbildung 4E–G). Da Kollagenase hauptsächlich die Peptidbindungen innerhalb von Kollagenmolekülen an den charakteristischen Gly-X-Y-Triplets spaltet, wobei X und Y oft Prolin- oder Hydroxyprolinreste sind, erzeugt der enzymatische Digestionsprozess kleinere Peptidfragmente. Das Vorhandensein größerer Peptidfragmente in vernetzten Proben, besonders im Bereich von Spitze 1, ist ein Hinweis auf die Wirksamkeit der Vernetzung bei der behindernden enzymatischen Spaltung. Dieses Ergebnis war besonders ausgeprägt im UVA/R-Quervernetzungsbereich, wo die beträchtlichen Peptidentitäten bis zu einem gewissen Grad erhalten blieben.
Abbildung 4. Umfassende Charakterisierung der nicht vernetzten Kollagenmatrizen (Col), UVA/R-Kreuzbindungskollagen (Xcol_UVA/R), EDC/NHS-vernetzten Kollagenmatrizen (Xcol_EDC/NHS) und Genipin-Kreuzvernetzungskollagen (Xcol_Genipin). A–D) Raman-Mikrospektroskopische Analyse: (A) Durchschnittliche Raman-Spektren, die deutliche Gipfel und Muster hervorheben. Jede Bedingung wurde mindestens dreimal repliziert (n ≥ 3), wobei für jede Replikation mehrere Spektren erhalten wurden (n ≥ 25). Multivariate Datenanalyseergebnisse umfassen Principal Component Analysis (PCA)-Ergebnisse mit PCA-Spektrallastungen von PC-3 und PC-4 (C), Score-Plot von PC-4 versus PC-3 (B) sowie statistische Darstellung der PC-3- und PC-4-Werte als Mittelwerte ± SD (D). Konfidenzellipsen in (B) stehen für 95%-Konfidenzintervalle. E–G) Größenausschlusschromatographie-Analyse: Spuren, die das Verhalten von Kollagenmatrizen zeigen, wie sie mit einem UV-Detektor detektiert werden. Nahaufnahmen von Gipfel 1 und Gipfel 2 sind in (F) und (G) dargestellt. Dynamischer H) Speichermodul (G') und I) sowie Verlustmodul (G''), der während Frequenzsweeps aus dem Plateau-LVE-Bereich extrahiert wird.
ähnlich wie bei chemisch vernetzten Proben. Eine solche Beobachtung unterstreicht die vergleichbare Wirksamkeit von UVA/R-Querverbindungen mit traditionellen chemischen Methoden wie EDC/NHS und Genipin beim Schutz von Kollagenmatrizen vor der enzymatischen Verdauung. Darüber hinaus zeigte die UVA/R-Vernetzung ein vorteilhaftes Profil mit weniger kleineren Nebenprodukten im Vergleich zur chemischen Vernetzung.
Die Chromatogramme der EDC/NHS- und genipin-behandelten Proben zeigten zusätzliche Spitzen, was auf das Vorhandensein von Nebenprodukten hindeutet, die bei biomedizinischer Anwendung potenziell zytotoxische Effekte verursachen oder Immunantworten auslösen könnten. Im Gegensatz dazu scheint das UVA/R-Crosslinking-Verfahren zu einem saubereren Profil mit weniger Fragmentierung geführt zu haben, was zu einem günstigeren Sicherheitsprofil für In-vivo-Anwendungen führen könnte. Die durch UVA/R-Vernetzung aufrechterhaltene molekulare Integrität sowie das reduzierte Nebenproduktprofil positionieren es als wirksame Methode zur Herstellung kollagenbasierter Biomaterialien für regenerative Medizin.
2.3.3. Rheologische Eigenschaften
Die rheologischen Eigenschaften von gekreuzten Kollagenmatrizen, analysiert durch dynamische Scherspannungsamplitude und Frequenzsweeps, lieferten Einblicke in die mechanischen Auswirkungen jeder Vernetzungsstrategie bei physiologischen Temperaturen. (Abbildung 4H,I) Xcol_UVA/R zeigte ein verbessertes elastisches Profil, was sich an seinem Speichermodul zeigt, ohne einen entsprechenden Verlust an Materialwiderstandsfähigkeit. Dieses Gleichgewicht zwischen Elastizität und Haltbarkeit unterstreicht das Potenzial der UVA/R-Vernetzung, die mechanische Integrität von Kollagengerüsten zu stärken, ohne die Fähigkeit des Materials, Energie zu absorbieren und zu dissipieren, zu beeinträchtigen, was eine wesentliche Eigenschaft für Biomaterialien ist, die dynamische physiologische Umgebungen durchlaufen müssen.
Andererseits zeigte Xcol_EDC/NHS ein unerwartet geringeres Speichermodul (Abbildung 4I), was darauf hindeutet, dass eine chemische Vernetzung mit EDC/NHS zwar das Material verändert, aber möglicherweise nicht gleichmäßig die elastischen Eigenschaften der Kollagenmatrix verbessert. Diese Erkenntnis könnte Auswirkungen auf die Anwendung von EDC/NHS-Querverbindungsmaterialien in Situationen haben, in denen mechanische Festigkeit Voraussetzung ist. Im Gegensatz dazu zeigte Xcol_Genipin eine deutliche Verringerung der Festigkeit, was sich an seinem höheren Speichermodul zeigt. Die erhöhte Starrigkeit kann jedoch die funktionale Kompatibilität des Materials einschränken, insbesondere im Hinblick auf Cellular-Aktivitäten. Materialien, die übermäßig STI sind, könnten potenziell die Zellmigration und -proliferation behindern, was beides für die Geweberegeneration und -integration entscheidend ist.
Zusammen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass UVA/R-Vernetzung ein optimales Gleichgewicht zwischen Steifheit und Flexibilität erreicht, was für zelluläre Funktionen förderlich sein könnte und somit einen vielversprechenden Weg für die Weiterentwicklung kollagenbasierter Scaolds für die regenerative Medizin bietet.
2.3.4. Thermische Stabilität
Dierentiale Scanning-Kalorimetriemessungen (DSC), dargestellt in Abbildung 5A, B, lieferten wesentliche Einblicke in die fehlerhafte Stabilität der Kollagenmatrizen. Die Denaturationstemperatur (Tm), die als Peak auf den DSC-Kurven beobachtet wird, markiert den Transitionspunkt, an dem die Kollagen-Dreifachhelix durch den Abbau stabilisierender Wasserstoffbrücken beginnt, sich abzuwickeln. Dieses thermische Ereignis wird von der Wärmeaufnahme begleitet, die quantitativ als Änderung der Enthalpie (ΔH) gemessen wird.
In unserer Studie wurde eine deutliche Erhöhung des Tm für die gekreuzten Kollagenproben festgestellt. Insbesondere zeigen Xcol_UVA/R und Xcol_EDC/NHS Tm-Werte bei 75 bzw. 76,0 °C, was auf eine verbesserte thermische Stabilität hinweist, die potenziell zur Erhaltung der strukturellen Integrität bei physiologischen Temperaturen förderlich ist. Xcol_Genipin zeigt zwar ein niedrigeres Tm bei 60,1 °C, zeigt aber dennoch einen erhöhten thermischen Widerstand im Vergleich zu nicht vernetztem Kollagen. Die mit dem Denaturierungsprozess verbundenen Enthalpie-Veränderungen (ΔH), wie in Abbildung 5B dargestellt, stützen diese Ergebnisse weiter, wobei Xcol_UVA/R und Xcol_EDC/NHS eine erhebliche Wärmeaufnahme nachweisen, die die Energie widerspiegelt, die benötigt wird, um die gestärkte Kollagenstruktur durch Vernetzung zu stören. Diese thermodynamischen Eigenschaften implizieren, dass die Vernetzung den Kollagenmatrizen zusätzliche Stabilität verleiht, was für deren Leistung unter thermischem Stress in vivo entscheidend ist.
2.3.5. Degradationsbeständigkeit
Unsere Studie wurde auf eine vergleichende Abbauanalyse von gekreuzten Kollagenmatrizen in physiologisch relevanten Bedingungen unter Verwendung von phosphatgepuffertem Kochsalzlösung (PBS) und Kollagenase-Solutionen erweitert (Abbildung 5C, D). Das Abbauprofil von Xcol_UVA/R war besonders überzeugend und zeigte eine Resistenz, die chemisch vernetzten Matrizen entspricht, was eine deutliche Verbesserung gegenüber dem nicht gekreuzten Kollagen darstellte. Diese Beobachtung ist entscheidend, da sie die erste ist, die die Degradationsresistenz von UVA/R-Kollagen direkt mit chemisch vernetzten Varianten vergleicht. Xcol_EDC/NHS zeigte außergewöhnliche Haltbarkeit im PBS und hielt nach 30 Tagen über 60 % seiner Masse, was auf sein Potenzial für Anwendungen hinweist, bei denen längere Stabilität von größter Bedeutung ist. Genipin-vernetztes Kollagen zeigte ebenfalls eine bemerkenswerte Resistenz in Kollagenase-Lösungen, was auf seine Eignung für Umgebungen mit aktivem enzymatischen Abbau hindeutet.
Die Robustheit dieser chemisch vernetzten Masken wirft jedoch im Kontext der Gewebetechnik Bedenken auf, bei der die Abbaukinetik des Gerüsts mit der Geweberegeneration synchronisiert werden muss. [75] Biomaterialien, die zu langsam abbauen, können den empfindlichen Prozess der neuen Gewebebildung stören, was möglicherweise mit Zellwanderung, Gefäßbildung und dem natürlichen Tissue-Remodellierungsprozess einwirkt. [30] Darüber hinaus kann das anhaltende Vorhandensein nicht degradierter Materialien eine anhaltende Entzündungsreaktion auslösen, die die Heilungsergebnisse negativ beeinflussen kann. [31] In der Techniktechnik sollte das ideale Biomaterial zunächst mechanische Unterstützung bieten, aber allmählich an neu entstandene Tisse abtreten. Daher ist es entscheidend, die Abbaurate zu optimieren, um einen nahtlosen Übergang vom Gerüst zum nativen Gewebe zu gewährleisten. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit eines nuancierten Ansatzes für die Gestaltung kollagenbasierter Gerüste, mit dem Ziel eines empfindlichen Gleichgewichts, das die anfängliche Gewebereparatur unterstützt und anschließend die naturale Gewebeintegration ermöglicht, ohne chronische Entzündungen oder andere negative Reaktionen auszulösen.
2.3.6. In-vitro-Zytotoxizitätstest
Die Biokompatibilität unserer Kollagenmatrizen wurde durch den CCK-8-Test unter Verwendung von L929-Fibroblasten untersucht, basierend auf den Richtlinien DIN EN ISO 10993–5: 2009 und DIN EN 10993-12: 2021. Der Standard besagt, dass Biomaterialien die Zelllebensfähigkeit nicht unter 70 % der Kontrolle reduzieren sollten, um als biokompatibel zu gelten. Wie in Abbildung 5E gezeigt, zeigten die vernetzten Kollagenmatrizen, insbesondere Xcol_EDC/NHS, eine verminderte Zelllebensfähigkeit auf, was auf potenzielle Zytotoxizität durch restliche Vernetzungsmittel oder Nebenprodukte hindeutet. Im Gegensatz dazu überschritt Xcol_UVA/R die Biokompatibilitätsschwelle mit einer Lebensfähigkeit von über 80 %, was seine Eignung für Tissue Engineering aufgrund des günstigen Gleichgewichts zwischen Stabilität und Abbau unterstreicht.
Abbildung 5. Charakterisierung von Kollagenmatrizen und in-vitro-biologische Bewertung. A) Differential-Scanning-Kalorimetrie-(DSC)-Kurven, die die thermischen Übergänge von Kollagenmatrizen illustrieren, markiert mit Spitzentemperaturen (Tm). B) Enthalpieveränderungen (ΔH) während der Denaturierung der Kollagenmatrizen. Massenverlust während der In-vitro-Abbau in C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und D) Kollagenaselösung. E) In-vitro-Zytotoxizitätstest mit L929-Fibroblasten mittels CCK-8-Test nach dem ISO 10993–5-Standard. F) Repräsentative konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-(CLSM)-Bilder von lebenden-toten (Calcein-PI) Färbungen von L929-Zellen, die 1, 4 und 7 Tage nach der Aussaat auf Kollagengerüsten kultiviert wurden. G) Quantitative Analyse des Verhältnisses lebender zu toter Zelle, abgeleitet aus den CLSM-Bildern, unter Verwendung der ImageJ-Software zur Zellquantifizierung. H) Quantifizierung lebender Zellen, wobei die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen über den Studienzeitraum hinweg hervorgehoben werden. Die statistische Bewertung der Teile (G) und (H) wurde mit ANOVA für mehrere Vergleiche zu unterschiedlichen Zeitpunkten durchgeführt, wobei spezifische Vergleiche zwischen der Xcol_UVA/R-Gruppe und anderen Gruppen vorgenommen wurden. (Die Maßstabsbalken in den Live-Dead-Färbungsbildern entsprechen 100 μm. Calcein in Grün, PI in Rot.).
Die lebende Tote-Färbung (Abbildung 5F) mit der anschließenden quantitativen Analyse (Abbildung 5G, H) hob die überlegene Leistungsfähigkeit von Xcol_UVA/R hervor, die das Überleben und die Zellproliferation unterstützte. Anfangs waren am ersten Tag die Lebend-/Toten-Verhältnisse für Col- und Xcol_UVA/R-Gruppen vergleichbar, was die Ergebnisse des in Abbildung 5E dargestellten Extraktionszytotoxizitätstests bestätigte. Als die Kultur jedoch zu den Tagen 4 und 7 voranschritt, zeigte das Xcol_UVA/R-Gerüst seine Überlegenheit mit deutlich verbesserter Zelllebensfähigkeit und -proliferation, was wahrscheinlich auf seine biomechanischen Eigenschaften zurückzuführen ist. Während das nicht gekreuzte Kollagengerüst trotz Biokompatibilität nicht die für optimale Zell-Material-Interaktionen notwendige strukturelle Integrität aufwies, wie seine Leistung nach 4 und 7 Tagen zeigt. Im Gegensatz dazu zeigten die Kollagenmatrizen mit EDC/NHS und Genipin während der gesamten Studiendauer verringerte Lebendzellverhältnisse, was Bedenken hinsichtlich ihrer zytotoxischen Profile aufwerfen könnte.
Unsere umfassenden Analysen zu enzymatischen Diges-Profilen, mechanischer Festigkeit, thermischer Stabilität und Abbaubeständigkeit zeigen im Vergleich zu in-vitro-Zytotoxizitätsbewertungen eine vielschichtige Bewertung von vernetzten Kollagenmatrizen für biomedizinische Anwendungen. Xcol_UVA/R sticht durch sein ausgewogenes Profil hervor; Es weist eine vergleichbare thermische Stabilität und Abbaubeständigkeit wie chemisch vernetzte Gegenstücke auf, bewahrt die strukturelle Integrität unter physiologischen Bedingungen und unterstützt gleichzeitig eine robuste Zelllebensfähigkeit und günstige Zell-Material-Interaktionen.
Die enzymatischen Verdauungsergebnisse, die auf einen reduzierten Abbau in vernetzten Proben hindeuten, stimmen mit der beobachteten Verbesserung mechanischer und thermischer Eigenschaften überein und bestätigen die Wirksamkeit der Vernetzung bei der Stärkung der Matrix-Widerstandsfähigkeit. Die mechanische Robustheit und die verminderte Abbaubarkeit, wie sie inXcol_EDC/NHS und Xcol_Genipin zu sehen sind, könnten jedoch das empfindliche Gleichgewicht, das für die Geweberegeneration erforderlich ist, beeinträchtigen. Diese Matrizen zeigen einen begrenzten enzymatischen Abbau und eine erhöhte Wärmeresistenz, doch diese Beständigkeit könnte die natürliche Gewebeumbildung potenziell behindern, wie ihre geringere Zelllebensfähigkeit zeigt.
Im Bereich der Tissue Engineering, wo der Abbau des Gerüsts voraussichtlich den Weg für neues Gewebe für Giftung ebnet, werden Materialien wie Xcol_UVA/R bevorzugt, die eine optimale Stabilität und Abbaubarkeit bieten. Sie fördern zelluläre Funktionen, ohne eine langanhaltende Entzündungsreaktion auszulösen, und verbessern dadurch die Heilungsergebnisse. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Wahl der Crosslinking-Methode die Leistung des Gerüsts tiefgreifend beeinflusst, wobei UVA/R-Crosslinking sich als vielversprechender Ansatz zur Schaffung biokompatibler, stabiler und dennoch abbaubarer Gerüste etabliert hat, die erfolgreiche Tissue Engineering fördern.
2.4. Histologische Beurteilung subkutaner Implantate
Die außergewöhnliche Biokompatibilität und Osteokonduktivität von Colla-Gen machen es zu einem Grundpfeiler für Knochentransplantationen. Allerdings war sein Nutzen historisch gesehen durch biomechanische Stabilität begrenzt. Durch die Anwendung eines innovativen UVA/R-Vernetzungsverfahrens haben wir diese Einschränkung erfolgreich behoben und die mechanische Stabilität unserer Kollagengerüste erheblich verbessert. Die Integration anorganischer Knochensubstitute (BS) wie Hydroxyapatit und β-TCP bietet die notwendige mechanische Unterstützung für die langfristige Knochenremodellierung, ohne jedoch die ECM-Komponenten, die für frühe Zellinteraktionen und die Abbaubarkeit des Gerüsts entscheidend sind.
Unser innovatives, injizierbares Verbundgerüst mit UVA/R-gekreuzter Kollagenmatrix und BS ist daher darauf ausgelegt, sowohl das anfängliche Zellengagement als auch die dauerhafte Knochenremodellierung zu optimieren. Durch subkutane Untersuchungen und de-tailed histologische Untersuchungen der implantierten Gerüste haben wir ein differenziertes Verständnis der Materialintegrität und der Dynamik der Tissue-Reaktion gewonnen. Dies beinhaltet eine tiefgehende Analyse von Gewebereaktionen, insbesondere Immunantworten, um Biokompatibilität festzustellen und wichtige Erkenntnisse für zukünftige Anwendungen zu gewinnen. Dieser methodische Ansatz unterstreicht unser Engagement, die Interaktion zwischen unseren entwickelten Matrizen und biologischen Systemen gründlich zu erforschen.
2.4. 1. Gewebereaktionsanalyse
Movats Pentachromfärbung ist eine multifunktionale histologische Technik, die verschiedene Komponenten des konnektiven Gewebes deutlich markiert und deren Differenzierung in histologischen Schnitten erleichtert. In dieser Studie wurde die Pentachromfärbung von Movat mit einer Uti-Methode durchgeführt, um die Verteilung von GAG und Kollagen innerhalb der Gewebeschnitte visuell zu unterscheiden und halbquantitativ zu analysieren, wodurch die unterschiedlichen Verhaltensweisen der implantierten, nicht gekreuzten Kollagen- und UVA/R-vernetzten kollagenbasierten Gerüste (BS-Col und BS-Xcol_UVA/R) innerhalb der Gewebeumgebung sichtbar wurden (Abbildung 6A–C). Am 10. Tag nach der Implantation zeigten beide Gruppen Kollagenmatrizen innerhalb der Einnistungsbetten (Abbildung 6B).
Bemerkenswert ist, dass die BS-Xcol_UVA/R-Gruppe eine bemerkenswerte Haftung an der Knochensubstitutionsoberfläche zeigte, im Gegensatz zur lose assoziierten Matrix, die in der BS-Col-Gruppe beobachtet wurde, was auf eine verbesserte Matrixstabilität hindeutet, die möglicherweise durch den UVA/R-Vernetzungsprozess ermöglicht wird. Die quantitative Analyse bestätigte diese Ergebnisse weiter und deutete auf einen höheren Kollagengehalt an den BS-Xcol_UVA/R-Implantationsstellen im Vergleich zu BS-Col (Abbildung 6C) hin, was den tiefgreifenden Effekt von Crosslinking auf die Matrixintegrität beweisen könnte. Im Verlauf der Gewebebildung nahmen die anfangs ähnlichen Gly-Cosaminoglykan-(GAG)-Werte eine folgenschwere Wendung und zeigten im Laufe der Zeit eine Abnahme, was auf eine fortlaufende Gewebereaktion, zelluläre Aktivität und einen dynamischen Matrix-Remodellierungsprozess hindeutet.
Bis Tag 30 zeigte die BS-Xcol_UVA/R-Gruppe eine auffällige Kollagenretention, wobei die Matrix um die Knochenersatzflächen verharrte. Diese anhaltende Präsenz, bestätigt durch quantitative Analysen, hob die anhaltenden Auswirkungen der UVA/R-Vernetzung auf die Matrixstabilität hervor. (Abbildung6C) Das Gewebe innerhalb der Gerüste war gereift, was die erhöhte Gefäßversorgung in beiden Gruppen zeigte. Es wurde jedoch ein deutliches Immunsystemprofil beobachtet; die BS-Col-Gruppe zeigte eine höhere Prävalenz von Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen, was auf eine fortlaufende Reaktion auf den Abbau des Gerüsts hindeutet.
2.4.2. Bewertung der Immunantwort
Unsere histologische Untersuchung der Immunantworten an den subkutanen Implantationsstellen zeigte nuancierte Interaktionen zwischen den Abwehrmechanismen des Wirts und den implantierten kollagenmatrixbasierten Kompositen. Anfangs, am 10. Tag, waren proinflammatoriske CD11c-positive Makrophagen um die Implantate herum prominent.
Abbildung 6. In vivo Gewebereaktion und Immunantwort auf kollagenmatrixbasierte Materialien: BS-Col und BS-Xcol_UVA/R. A) Schematische Darstellung, die das injizierbare Verbundmaterial aus Kollagenmatrix und Knochensubstitut (BS) darstellt, das subkutan in die BALB/c-Maus implantiert wird.
B) Repräsentative histologische Bilder der Implantationsbereiche von BS-Col und BS-Xcol_UVA/R an den Tagen 10 und 30 nach der Implantation mittels Movats Pen-tachrome-Färbung. C) Quantifizierung von Movats Pentachrom mittels Farbdekonvolutionsanalyse mit ImageJ. Gelb-grün = Kollagen, grün-blau = Glycosaminoglykan (GAG). Präsentiert als Prozentsatz der gesamten befleckten Fläche. D) Repräsentative immunhistochemische Bilder proinflammatorischer (CD11c) und antiinflammatorischer (CD163) Makrophagensubtypen in den Implantationsbereichen der jeweiligen Gruppen. E) Histomorphometrische (quantitative) Analyse der CD11c-positiven und CD163-positiven Makrophagensubtypen in den Implantationsbereichen der jeweiligen Gruppen mittels ImageJ. Schwarze Sterne = Knochenersatz (BS), rote Sterne = neu gebildete Gefäße, orangefarbenes Dreieck = Kollagen, grünes Dreieck = multinukleare Riesenzellen, gelbes Dreieck = CD11c-positive Zellen, blaues Dreieck = CD163-positive Zellen. Skala = 100 μm.
In beiden Gruppen sind weniger CD163-positive antiinflammatorische Makrophagen im Peripheriebereich vorhanden (Abbildung 6D). Quantitative Bewertungen (Abbildung 6E) zeichneten die Immunlandschaft weiter ab und zeigten eine Überlegenheit von M1-Makrophagen (CD11c-positiv) gegenüber M2-Makrophagen (CD163-positiv) in der BS-Col-Gruppe mit Zellzahlen von 153,3 ± 29,0 Zellen/cm² bzw. 50,0 ± 14,7 Zellen/cm². Im Gegensatz dazu zeigte die BS-Xcol_UVA/R-Gruppe weniger M1-Makrophagen (122,0 ± 30,5 Zellen/cm²) und eine höhere Inzidenz von M2-Makrophagen (79,9 ± 24,2 Zellen/cm²), was auf eine moderierte proinflammatoriske Antwort hindeutet.
Bis Tag 30 wurde eine erkennbare Verschiebung der Makrophagenpolarisation beobachtet. Die BS-Col-Gruppe zeigte weiterhin eine starke CD11c-Expression (173,0 ± 42,1 Zellen/cm²) in der Implantatumgebung, mit nur geringer CD163-Expression. Im Gegensatz dazu zeigte die BS-Xcol_UVA/R-Gruppe einen deutlichen Anstieg der entzündungshemmenden CD163-positiven Makrophagen (115,0 ± 23,9 Zellen/cm²) und eine Reduktion der CD11c-Expression (76,5 ± 17,9 Zellen/cm²), wie in Abbildung 6E quantifiziert. Diese Verschiebung zeigt eine deutliche Neigung hin zu einem entzündungshemmenden Phänotyp in der BS-Xcol_UVA/R-Gruppe, mit einer auffälligen Abweichung vom persistenten pro-inflammatorischen Milieu in der BS-Col-Gruppe.
Die histologische Bewertung subkutaner Implantate liefert überzeugende Belege für die Wirksamkeit des UVA/R-Crosslinking-Prozesses bei der Verbesserung der Biostabilität und Integration von Kollagenmatrizen in einem biologischen Milieu. Das Vorhandensein von proinflammatorischen Makrophagen im frühen Stadium, das in ein entzündungshemmendes Profil in der BS-Xcol_UVA/R-Gruppe übergeht, zeigt eine typische akute Immunantwort, die für Wundheilung und Implantatintegration unerlässlich ist. Die reduzierten Abbauprozesse und das Vorhandensein von oxidiertem Tyrosin (DOPA) vernetztem Kollagen nach der UVA/R-Behandlung tragen wahrscheinlich synergetisch zu entzündungshemmenden Effekten bei. DOPA, das nach der UVA/R-Behandlung auch eines der Produkte in tyrosinhaltigen Peptiden war (Abbildung 3B), spielt eine bedeutende Rolle bei der Bekämpfung der Inflammation und verbessert potenziell die Biokompatibilität der Colla-Gen-Gerüste.
Dies eröffnet Möglichkeiten für weitere Forschung zu photochemisch vernetzten Biomaterialien in der Gewebetechnik und regenerativen Medizin, insbesondere um diese Mechanismen für kontrollierte Immunresponse bei der klinischen Integration und Funktionalität von Implantaten zu verstehen und zu nutzen. Während unsere Studie umfassende Einblicke in Biokompatibilität und mechanische Eigenschaften bietet, könnten zukünftige Forschungen mit der Analyse der zweiten harmonischen Generation (SHG) ein zusätzliches Verständnis der ultrastrukturellen Veränderungen in der Kolla-Gen-Fibrillarität bieten und unsere Erforschung von photochemisch vernetztem Kollagen für Gewebetechnik und regenerative Medizin bereichern.
Der optimierte UVA/R-Vernetzungsprozess verbessert die Integration unserer Collagen-Gerüste mit BS-Materialien und schafft so eine äußerst effektive Lösung für Knochentransplantationen. Dieser innovative Ansatz stärkt nicht nur die biomechanische Stabilität, sondern maximiert auch die Biokompatibilität des Verbundwerkstoffs, wodurch es für klinische Anwendungen gut geeignet ist. Durch die Integration anorganischer Partners in die Kollagenmatrix decken wir den wesentlichen Bedarf an dauerhafter mechanischer Unterstützung, die für eine erfolgreiche Knochenregeneration und -remodellierung entscheidend ist. Entscheidend ist, dass unsere Methode die anfänglichen Wechselwirkungen zwischen Zelle und Gerüst fördert – ein zentrales Element der Tissue Engineering – und gleichzeitig die mechanische Unterstützung bietet, die für die Knochenregeneration unerlässlich ist.
Über die Knochenregeneration hinaus erstreckt sich die Vielseitigkeit des UVA/R-Kreuzband-Kollagens auf eine Vielzahl von Anwendungen. Es dient als grundlegendes Material für die Knorpelreparatur, wobei seine Fähigkeit, die Verwachsung und Vermehrung von Chondrozyten zu unterstützen, entscheidend sein kann. Bei der Wundheilung beschleunigen seine ausgezeichnete Biokompatibilität und das förderliche Umfeld für die Zellmigration die Gewebereparatur.
Für die Gefäßtechnik unterstützt das Gerüst das Wachstum von Endothel- und glatten Muskelzellen, was für die Bildung funktioneller Blutgefäße unerlässlich ist. Bei der Nervenregeneration kann das Gerüst das Neuritwachstum lenken und bietet so einen vielversprechenden Weg zur Reparatur von Nervenverletzungen. Darüber hinaus machen die individuell angepassten Abbauraten des Materials und die Verträglichkeit mit verschiedenen bioaktiven Stoffen es zu einem ausgezeichneten Kandidaten für gezielte Arzneimittelabgabe und kontrollierte Freisetzungssysteme.
Um das volle Potenzial dieser Materialien in klinischen Umgebungen zu entfalten, ist ein tieferes Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen unerlässlich. Fortschrittliche Bildgebungs- und Spektroskopietechnologien werden bei dieser Erkundung eine entscheidende Rolle spielen und Einblicke in die Interaktion des Gerüsts mit biologischem Gewebe und deren Einfluss auf das Zellverhalten bieten. Dieses vertiefte Verständnis ist entscheidend, um die Materialien an die spezifischen Anforderungen verschiedener Anwendungen der regenerativen Medizin anzupassen und optimierte Ergebnisse für Gewebereparatur und -regeneration sicherzustellen.
3. Fazit und Ausblick
Das komplexe Zusammenspiel zwischen der Komplexität des Kollagenmoleküls und dem mysteriösen UVA/Riboflavin (UVA/R) photochemischen Vernetzungsprozess ist ein faszinierendes Rätsel, das unsere Studie geschickt gelöst hat. Unsere umfassende Untersuchung des Vernetzungsmechanismus von Kollagen mit sechs strategrafisch ausgewählten synthetischen Peptiden hat bemerkenswerte Erkenntnisse geliefert. HPLC, LC-MS zeigen immer wieder eine Präferenz für Tyrosin unter den Aminosäuren, eine Erkenntnis, die unser Verständnis der weit verbreiteten UVA/R-Vernetzungstechnik, insbesondere in der Augenheilkunde, erheblich verbessert.
Die präferentielle Zielsetzung von Tyrosin beleuchtet die spezifischen molkularen Signale, die an der UV-induzierten Kollagenstabilisierung beteiligt sind. Unsere Ergebnisse unterstreichen die Rolle von Tyrosin bei der UV-induzierten Querbindung, und die Phenolgruppe in Tyrosin ist ebenfalls bekannt dafür, anfällig für Photoaktivierung zu sein, was potenzielle technische Strategien für künstliche oder funktionalisierte Biomaterialien bietet. Über die Erläuterung der Mechanismen der UVA/R-Vernetzung hinaus deuten die Ergebnisse auf eine entscheidende Rolle des Tyrosin bei der Gestaltung und Bewertung kollagenbasierter Biomaterialien hin und fordern eine Neubewertung bestehender Materialien an, insbesondere solcher chemisch modifizierten durch Tyrosin-dominierte Vernetzung, was sowohl für Antragsteller als auch für Regulierungsbehörden relevante Fragen aufwirft.
Das in dieser Studie vorgestellte Approche befürwortet auch die Notwendigkeit einer Neubewertung und Optimierung der UVA-Vernetzungstechnik mit dem Fokus auf die Maximierung der Kontrollierbarkeit der Reaktion, etwa die Einbindung definierter Tyrosinreste in den Prozess durch kontrollierte Reaktionsbedingungen. Durch die Entwicklung synthetischer Peptide, die potenzielle Vernetzungsstellen widerspiegeln, haben wir den entscheidenden Einfluss von Tyrosinresten auf den Vernetzungsmechanismus entdeckt, insbesondere solche, die in nicht-helikalen Bereichen leben, die für die Verbesserung mechanischer Eigenschaften entscheidend sind. Unsere In-vivo-Studien an BALB/c-Mäusen haben die Biokompatibilität und funktionelle Wirksamkeit von UVA/R-Kreuzverband-Kollagen bestätigt und so sein überlegenes Potenzial als Biomaterial für therapeutische Anwendungen untermauert.
Wu Xi Further Pharmaceutical Co., Ltd
Hauptprodukte
Palmitoylethanolamid(PEA) Mikro (CAS 544-31-0)
Spermidin-Trihydrochlorid (CAS 334-50-9)
Pterostilben (CAS 537-42-8)
Luteolin (CAS 491-70-3)
Voglibose (CAS 83480-29-9) JP GMP
Mailbox:wuxifurther@gmail.com
Whatsapp:+86 18036885286
