Die strukturelle Bestätigung von Aminosäure-vernetztem Natriumhyaluronat (Hyaluronsäure, HA) erfordert eine umfassende Charakterisierung durch mehrere analytische Techniken, um die Vernetzungsstelle, den Vernetzungsgrad und die Molekularstruktur zu bestimmen.
Gewichtsveränderung und Integrität der chemischen Struktur. Die folgenden sind detaillierte Schritte und Methoden:
1. Probenreinigung und Vorbehandlung
Dialyse/Ultrafiltration: Entfernen von nicht reagierten Aminosäuren, Vernetzungsmitteln und kleinen Molekül-Nebenprodukten.
Gefriertrocknung: Trockene Proben für die Analyse erhalten.
2. Bestätigung der chemischen Struktur
(1) Infrarotspektroskopie (FT-IR)
Zweck: Bestätigung der Bildung von Querverbindungen (wie Amidbindungen, Esterbindungen).
Charakteristische Gipfel:
Natriumhyaluronat: Carboxylat (COO⁻, ~1600 cm⁻¹ und ~1400 cm⁻¹), Hydroxyl (~3400 cm⁻¹).
Nach der Aminosäure-Quervernetzung: neues Amid I-Band (C=O, ~1650 cm⁻¹), Amid II-Band (N-H, ~1550 cm⁻¹) oder Esterbindung (C-O). , ~1730 cm⁻¹) werden hinzugefügt.
(2) Kernmagnetische Resonanz (NMR)
¹H NMR und ¹³C NMR:
Erkenne die Proton-/Kohlenstoff-Signale des HA-Backbones (Glucuronsäure und N-Acetylglucosamin).
Bestätigen Sie die charakteristischen Peaks von Aminosäuren (wie α-H, Seitenkettengruppen).
Signale von Querverbindungen (wie neu gebildete Amidbindungen oder Esterbindungen).
Zweidimensionales NMR (COSY, HSQC): Hilft bei der Zuordnung von Querverbindungsstellen.
(3) Massenspektrometrie (MS)
MALDI-TOF MS oder ESI-MS:
Messen Sie die Änderung des Molekulargewichts vor und nach der Vernetzung, um den Grad der Vernetzung zu überprüfen.
Erkennen Sie mögliche Degradationsfragmente oder Nebenprodukte.
3. Analyse des Vernetzungsgrads und des Molekulargewichts
(1) Bestimmung des Vernetzungsgrads
TNBS-Methode (Trinitrobenzolsulfonsäure): Quantifizierung nicht reagierter freier Aminogruppen und indirekte Berechnung des Vernetzungsgrads.
Elementaranalyse: Bewerten Sie die Menge an Aminosäure, die durch die Änderung des Stickstoffgehalts eingeführt wurde.
(2) Molmassenverteilung
Gelpermeationschromatographie (GPC/SEC):
Verwenden Sie Multi-Angle-Lichtstreuung (MALS), um das absolute Molekulargewicht zu erkennen.
Vergleichen Sie die Änderungen des Molekulargewichts und der Verteilung vor und nach der Quervernetzung.
4. Thermische und morphologische Charakterisierung
(1) Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC)
Erkenne die Änderung der Glasübergangstemperatur (Tg) nach der Vernetzung, die die Einschränkung der Bewegung der Molekülketten widerspiegelt.
(2) Die Thermogravimetrische Analyse (TGA) bewertet die thermische Stabilität. Die Vernetzung erhöht normalerweise die Zersetzungstemperatur.
(3) Rasterelektronenmikroskopie (REM)
Beobachten Sie die mikroskopische Morphologie nach der Vernetzung (wie z. B. eine poröse Struktur oder ein dichtes Netzwerk).
5. Biologische und funktionelle Verifikation
(1) Enzymatische Stabilität
Behandeln Sie mit Hyaluronidase und vergleichen Sie die Abbaurate vor und nach der Quervernetzung.
(2) Schwellungseigenschaften
Bestimmen Sie die Gleichgewichtsschwellungsrate des vernetzten Hydrogels, um die Dichte des Vernetzungsnetzwerks widerzuspiegeln.
6. Andere Hilfstechniken
Röntgenbeugung (XRD): Analysieren Sie die Veränderung der Kristallinität (Quervernetzung führt häufig zu Amorphisierung).
Raman-Spektroskopie: Ergänzende Bestätigung der Informationen über chemische Bindungen.
Fluoreszenzmarkierung (falls die Aminosäuren aromatische Gruppen enthalten): Verfolgen Sie die Quervernetzungsstelle mittels Fluoreszenzspektroskopie.
Anmerkungen
1. Kontrollexperiment: Unvernetztes Natriumhyaluronat und freie Aminosäuren müssen als Kontrollen festgelegt werden.
2. Optimierung der Bedingungen: Die Bedingungen der Vernetzungsreaktion (pH值、温度、时间) können die Struktur beeinflussen und müssen im Bericht vermerkt werden.
3. Datenassoziation: Kombinieren Sie die Ergebnisse verschiedener Methoden und validieren Sie die Querverbindungsstruktur gegenseitig.
Durch die oben genannte multidimensionale Analyse können die chemische Struktur, die Vernetzungsstelle und die Materialeigenschaften von Aminosäure-vernetztem Natriumhyaluronat vollständig bestätigt werden.
